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成功的IHC/ICC實驗操作指南(五)

實驗的每一小步,都是決定結果的一大步。本期將為大家講解IHC/ICC實驗中一抗的選擇和優化,喜歡的話就繼續往下看吧!

在設計IHC/ICC實驗時,一抗的選擇是最重要的因素。而一抗的關鍵特征是抗原表位的特異性。IHC/ICC實驗的所有步驟都必須經過優化,以便觀察到特異染色,并盡可能減少非特異的背景染色。這包括開展預實驗,以確定每個一抗的適當孵育條件。抗原親和純化的多克隆抗體的稀釋度通常低于單克隆抗體,但這些值必須根據經驗確定。為了獲得可靠特異的信號,應當采用交叉反應性極少的高質量抗體。

1 一抗供應商的選擇

在搜索一抗時,產品很可能有幾個不同的商業來源,而它們的抗體質量可能參差不齊。最初的選擇也許決定了這是個成功的實驗,抑或是個錯失的機會。第一步是尋找獨立驗證。這包括在文獻中檢查抗體過去是否成功使用。許多供應商(包括R&D Systems)都可以為尋找這信息的研究人員提供協助。另一個問題是詢問抗體是否真的由供應商制造,還是它采購了之后轉售?直接購買確保了供應商對制造、質量控制流程、以及運輸和儲存條件的完全控制。此外,一旦抗體的使用出現問題,制造商是提供優質技術服務的最佳選擇。

2 單克隆還是多克隆

單克隆和多克隆抗體的內在特征決定了它們用于IHC/ICC時的優勢和限制。單克隆抗體由單個B細胞克隆產生,代表了同質群體,能夠高親和力高特異性地與單個表位結合。這在檢測蛋白家族的某個成員時特別有用,因為蛋白家族有著高比例的氨基酸同源性。

抗體結合往往依賴于目標蛋白維持其天然的構象狀態。與其他蛋白的相互作用、翻譯后修飾、溫度、pH、固定和鹽濃度都會影響抗體接近目的表位。多克隆抗體是異質的,可識別多個表位,因此它們較少受到蛋白構象變化的影響。一般而言,多克隆抗體在一定pH和鹽濃度范圍內也比單克隆抗體更為穩定。基于這些原因,多克隆抗體更常用于IHC/ICC實驗。

3 多克隆抗體的親和純化

多克隆抗血清是抗體混合物,它們由大量B細胞克隆產生。組成多克隆抗血清的抗體以不同的特異性和親和力與目標表位結合,也與不相關的目標分子交叉反應(非特異相互作用)。為了富集與目的抗原特異性和親和力最高的抗體,R&D Systems的多克隆抗體經過抗原親和純化。在此過程中,多克隆抗血清流過固定了抗原分子的親和柱。特異抗體被固定了的抗原保留,而非特異抗體流過柱子,被丟棄。隨后從柱子上洗脫經抗原親和純化的抗體。抗原親和純化的抗體主要與目的抗原相互作用,降低了背景染色,與未純化抗體相比產生了更一致的結果。

單克隆和多克隆抗體結合的區別。單克隆抗體只與單個表位結合,而多克隆抗體與同一個蛋白的不同表位結合。

4 一抗孵育條件的優化

抗濃度、稀釋液、孵育時間和溫度都影響染色質量。這些變量需要針對每個抗體和樣品來優化,以便實現特異染色和低背景。優化通常是保持孵育時間和溫度不變,而改變抗體濃度,以確定何時獲得最佳信號和低背景噪音。例如,如果使用高親和力的抗體,那么相對較高的濃度可能需要較短的孵育時間。相反,較低的抗體濃度可能需要較長的孵育時間。人們通常采用較長的孵育時間,以確保抗體完全滲透到組織切片。為了促進特異染色,較長時間的孵育通常在低溫下開展(即4°C vs.室溫)。

R&D Systems組織切片染色方案的優化首先是一抗在4°C孵育過夜對于細胞染色,通常選擇在室溫下與一抗共同孵育1小時。抗原親和純化過的多克隆抗體的工作濃度(1.7-15μg/mL)通常比單克隆體(5-25μg/mL)要低。在比較不同濃度的相同抗體染色的樣品時,在孵育步驟時必須使用一致的時間和溫度。當第一次使用新抗體時,建議開展預實驗,檢驗各種抗體濃度

5 一抗孵育的起始條件

 

以上文字和圖片來源于Bio-techne。

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