拳皇命运手游攻略视频
EN

IHC實驗疑難解析大匯總

本周小編將帶來IHC系列培訓的最后一講,IHC實驗中各種常見問題的原因分析和解決方案。希望通過本次課程,您可以了解到 IHC 實驗中出現異常情況時您可采取的措施。

一、切片無染色 

IHC 中可能遇到的一個主要問題是無染色。出現這一問題的原因主要有三個:

  • 蛋白表達量低/無表達 

  • 樣本制備不良 

  • 試劑/方案問題 

1、表達量低/無表達

  • 確定目標蛋白的表達量,用工具查詢,Uniport官網: https://www.uniprot.org/

  • 了解目標蛋白表達的種屬特異性和組織特異性,有時候目標蛋白在一些常見種屬(如:人)有表達,并不表示在其他種屬上也有表達。

解決方案:

  • 在實驗前查詢文獻,確定您待檢測的目標種屬和組織的表達量情況

  • http://www.proteinatlas.org/,在這個網站上會提供人體組織的不同蛋白RNA表達數據和IHC數據,可以作為參考;

  • 在實驗方案中添加陽性對照組織樣本,驗證實驗體系的正確性;

  • 陽性對照的細胞系,一些情況下,可以選擇確定會表達目標蛋白的細胞系作為陽性對照;

  • 質量優良的抗體說明書上會給出建議的陽性對照樣本,可以作為參考。

圖1、人體不同組織的表達分布,來源:proteinatlas官網

2、樣本制備不良

  • 固定步驟:過度固定組織或固定時間不夠;固定時使用福爾馬林和多聚甲醛固定劑可能會遮蔽抗體識別的表位。

解決方案:

  • 不同的抗原修復方法暴露表位(用 pH 6 或 pH 9 緩沖液熱修復、酶修復等)。

  • 如果過度固定,則需要縮短固定時間。

  • 可能脫蠟不充分

解決方案:

  • 延長脫蠟時間,且需要使用新鮮二甲苯

 

圖2 、不同修復液對染色效果的影響

3、試劑/方案問題

  • 一抗問題:

  • 濃度太低:按照說明書上的建議,梯度稀釋抗體后實驗,選擇合適的濃度。

  • 孵育時間不夠:嘗試在 4°C 孵育更長時間(例如過夜)。

  • 抗體可能不適用于IHC應用,因為其可能無法識別蛋白質的天然(3D)構象。

檢查抗體數據表,查看其是否在 IHC 中得到了驗證及其 IHC 的類型(石蠟切片、冰凍切片等)。抗體在免疫細胞化學(ICC)或免疫沉淀(IP)中的成功使用暗示了抗體能夠識別蛋白質的天然構象。  

  • 二抗問題:

  • 使用的二抗為抗一抗宿主的抗體(例如,如果在兔中生產一抗,則使用抗兔二抗)。檢查一抗的亞型是否被二抗識別。

  • 用其他蛋白的一抗檢測二抗效果,確保二抗正常使用。

二、高背景

免疫組化染色之后的高背景是困擾很多實驗者的常見現象,如果您遇到類似問題,可以對照下表的分析,嘗試相應的解決方案。

可能的問題原因

解決方案

沒有封閉或封閉不足

  • 增加封閉時間,考慮更換封閉劑。如果使用血清,Abcam 推薦使用二抗種屬來源的正常血清(10%)封閉 1 小時。

  • 試用商業化封閉緩沖液。

  • 另一種選擇是嘗試預吸附二抗。

  •  

一抗濃度可能過高

滴定抗體至最佳濃度,進一步稀釋抗體并在 4℃ 孵育(緩慢孵育,但有針對性地結合效果最佳)。

 

孵育溫度可能過高

  • 4°C 下孵育切片。

  •  

二抗可能是非特異性結合

  • 使用不加一抗只加二抗的對照。

  • 如果您只看到二抗非特異性染色,請更換二抗,或者使用預吸附二抗。

  •  

組織沖洗不充分,仍殘留固定劑

  • 所有步驟之間用 PBS 充分沖洗。

  •  

內源性過氧化物酶具有活性

  • 用酶抑制劑,使用左旋咪唑 (2 mM) 抑制堿性磷酸酶,或用H2O2(0.3% v/v) 抑制過氧化物酶。

  •  

檢測系統是熒光顯微鏡,固定過程引起自發熒光

  • 福爾馬林/PFA 通常在綠色光譜中出現自發熒光,因此可試用在紅光譜內的熒光基團。

  • 如果您有紅外檢測系統,可以使用紅外范圍內的熒光基團。

  •  

信號擴增過多(間接技術)

  • 減少擴增孵育時間,稀釋二抗或擴增試劑盒試劑。

  •  

應用過多底物(酶檢測)

  • 更大倍數稀釋底物,減少底物孵育時間。

  •  

色原與組織樣本中PBS 反應(酶檢測)

  • 在與底物孵育前使用 Tris 緩沖液清洗切片。

  •  

通透破壞細胞膜并去除膜蛋白(膜蛋白)

  • 更換通透劑(如用 Tween® 20 代替 Triton™ X-100)

  • 使用不含通透劑的緩沖液。

三、非特異性染色

非特異性染色也是小編在日常工作中被問到頻率較高的問題,希望下面這些建議一次性解答您的各種疑問。

  • 一抗/二抗濃度可能過高。

    • 嘗試降低抗體濃度和/或縮短孵育期。可以與不表達靶蛋白的陰性組織進行比較。

  • 內源性過氧化物酶具有活性。

    • 用酶抑制劑,使用左旋咪唑 (2 mM) 抑制堿性磷酸酶,或用 H2O2 (0.3% v/v) 抑制過氧化物酶。

  • 一抗是抗染色組織來源物種的抗體(例如在小鼠組織樣本上使用小鼠一抗)。當應用二抗時,其與組織樣本結合,因為其為抗該種屬抗體。

    • 使用的一抗為針對與您組織來源物種不同物種的抗體。

    • 使用商業化試劑盒(例如,mouse on mouse 試劑盒:ab127055)。

  • 切片/細胞已經干燥。

    • 將切片/細胞保持在高濕度下以防變干。

總結

您現在應該已經完全了解了 IHC 的常見疑難問題知識,包括:

1、切片無染色的原因及解決方法;

2、遇到高背景染色結果時的處理方案;

3、排除非特異性染色時的做法。

希望您通過這次系列培訓了解所有相關實驗知識,使您可以順利完成所有實驗。IHC 的培訓到這里就結束了。請務必把這些信息保存在安全的地方,以備日后參考。

 

本文內容來源于abcam官網。

中源生物是Abcam公司授權的一級代理商

如有相關問題請撥打免費服務電話咨詢

400-8100-881

如您對我們的服務有任何的意見和建議請發至如下郵箱

[email protected]

附件:
 
拳皇命运手游攻略视频 注册送体验金38电子游戏 重庆时时历史开奖号码 安徽的快三开奖结果 足彩开奖结果查询奖金 北京赛计划 时时彩服务器 黑龙江时时规则 北京11选5开奖结果一定牛 3d开奖直播今天 双色球开奖结果19068期 欧洲足球赛事 玩百家樂两个平台对打赚返水 彩票团队赚钱真的假的 欧洲秒速时时